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SOLUÇÃO TRIPSINA / EDTA


 











UTILIZAÇÃO:

PARA REMOVER CÉLULAS DE CULTURAS ADERIDAS AO FRASCO:

1. Remova por inversão ou por aspiração todo o meio do frasco de cultivo. 2. Adicione cerca de 0,1 ml/cm2 da solução de Tripsina/EDTA para lavar rapidamente a superfície de células. Essa manobra é rápida e serve para remover o soro remanescente. Pode-se utilizar meio de cultura ou solução balanceada em maior quantidade, mas sem soro, o que permitirá maior economia da Solução de Tripsina. 3. Adicionar cerca de 0,05 ml/cm2 da Solução de Tripsina/EDTA sob a superfície celular e observar ao microscópio. Quando as células adquirirem um aspecto redondo e individualizado, deslocando-se do tubo, pode-se interromper o processo com a adição de 0,2 ml/cm2 de meio com soro à 10%. Como o soro possui alfa 1-anti-tripsina, ele neutralizará a ação da tripsina. Quando se trabalha com monocamadas celulares que ocupam todo o frasco, o descolamento pode ser observado a olho nú e o meio se apresentará como se tivesse uma fina areia. É importante que a neutralização com soro se faça logo após o descolamento da camada celular, uma vez que a membrana, por ser lipo-proteica, sofre a ação protelítica da tripsina. 4. A seguir, as células são homogeneizadas e contadas para diluição, congelação, repiques celulares, etc.

PARA REMOVER CÉLULAS DE ÓRGÃOS OU TECIDOS:

1. Lavar bem o órgão ou tecido em meio sem soro.
2. Com o auxílio de uma tesoura de íris, picotar o órgão em pedaços bem pequenos (+1mm).
3. Aspirar todo o sobrenadanete (os pedaços geralmente não boiam)
4. Adicionar Tripsina/EDTA em volume de 3 a 10 vezes o correspondente do tecido picotado.
5. Agitar lentamente em um Erlenmayer, com o auxílio de um agitador magnético com imã revestido de PTFE e estéril. O tempo de coleta da Tripsina com células pode ser com intervalos de 10, 20 ou 30 minutos.
6. Após o tempo de ação da Tripsina, aspirar o sobrenadante e vertê-los para tubos contendo meio completo com soro à 10%. A proporção será de volume a volume, isto é, para cada 10 ml de sobrenadante, misturar outro ml de meio completo com soro. Veja que a extração de células do Erlenmayer poderá continuar a ser feita, bastando para isso adicionar mais Tripsina/EDTA.
7. Centrifugar por 10 minutos à 1000 RPM os tubos contendo Tripsina com meio completo, desprezar o sobrenadante e adicionar novo meio completo.
8. Homogeneizar e distribuir as células em frascos de cultivo de acordo com a vitalidade e densidade celular desejada.

APRESENTAÇÃO:
Frascos com 50 ml
CONCENTRAÇÃO: Tripsina: 2,5g/L - Atividade 1:250

VALIDADE:
12 meses
CONSERVAÇÃO:
de 0 à -20° C

 
DEFINIÇÃO: É uma solução balanceada com tripsina sem Íons, Cálcio e Magnésio e com um agente quelante. AÇÃO: Age permitindo o "descolamento" das células de frascos de cultivo e/ou desagregando células entre si através de sua propriedade proteolítica sobre proteínas intercelulares, e ainda alterando a estabilidade das membranas ao quelar o íon cálcio.

INDICAÇÃO: Ela é utilizada para a separação de células de órgãos ou tecidos ou mesmo cultivadas em mono ou pluricamadas.

VANTAGENS: Como o processo de descolamento e separação de células pode ser acompanhado ao microscópio, poder-se-á controlá-lo interrompendo a sua ação, pela simples adição de meio contendo soro animal ou humano.

CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUIMICAS:

1.) Aspecto : róseo, límpido e transparente
2.) pH : 7,0 + 0,2
3.) Osmolaridade : 295 + 5%

CONSERVAÇÃO: Descongelar apenas no momento de uso e congelando-a após. Como é uma enzima proteolítica, ela pode sofrer auto-digestão diminuindo sua atividade. A alteração para valores mais próximos de 7,9 (mais róseo) e sua utilização à 37oC provocam um aumento de sua atividade, ocorrendo o inverso com abaixamento do pH e de temperatura.


COMPOSIÇÃO TRIPSINA/EDTA

COMPONENTES g/L
   
NaCl 8,00
KCl 0,40
Na2HP4 0,06
KH2PO4 0,06
GLICOSE 1,00
TRIPSINA 2,50
EDTA 0,10
BICARBONATO 0,35
GARAMICINA 0,05
FENOL VERMELHO 0,01
OBS.: DILUINTE: SOLUÇÃO DE HANKS S/ CA S/ MG